CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指将外源性基因通过同源重组（HDR）的方式插入到基因组中，使其在细胞内稳定表达的一种基因编辑技术。 KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的…

2023年9月14日 · 进行基因编辑时，人工核酸内切酶能够识别并切断靶DNA序列，产生DNA双链断裂（Double-strand break，DSB），然后细胞会进行及时修复，主要有两种修复途径：非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（Homologous directed repair, HDR）。

基因敲入（gene knock in）是一种将外源功能基因，整合或替换到基因组特定位点，并在细胞内获得稳定表达的技术。 它在基因功能、疾病模型、药物筛选等研究领域有着广泛的应用。 然而，基于基因敲入依赖于同源重组（Homologous Recombination）的特点，一定程度上决定了其低概率性，即效率低下始终是基因编辑领域的一大瓶颈，即便结合第三代基因编辑系统CRISPR/CAS9这一强大技术，精确定点敲入的仍然常常难以高效的实现。

2021年1月4日 · 我搞得蛋白质是一个11KD的分泌性蛋白，并且是我实验设计中一个重要的指标，最初学习WB技术，受困于二抗不合格一直连内参都做不出来。 后面改换抗体之后，才相对顺利一点，其他指标也相继出来了。 所以抗体真的很重要。 但是在做WB实验的7、8个月过程中，我的核心的一个蛋白一直处于混沌状态，可能跑30次能现身一次，现身之后又没影好几个月，就这样捉摸不定，搞得我很烦，但又无可奈何。 询问了实验室的同学们，说法各一： 1、有人说小分子 …

本篇文章主要从实验原理、实验流程步骤，两方面来介绍 CRISPR-Cas9 基因敲除系统（knockout）和CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in） CRISPR-Cas9基因敲除系统. 实验流程： 1设计sgRNA. 2构建sgRNA-Cas9载体. 3构建sgRNA-Cas9稳转株. 4 筛细胞克隆并进行qPCR验证. 5 阳性克隆测序，选择敲除純合 细胞株. 6 筛选细胞单克隆测序. 实验步骤： 1、设计sgRNA. 针对小鼠LIF 基因座 （Musmusculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。 进行 软件分析 以确 …

下图是在大肠杆菌BW25113菌株中插入T7RNAP片段。 Schematic illustration of DSB induction and homologous recombination. 如何实现CRISPR-Cas9靶向敲入insertion /knock in 敲入 有三种方法 先来说一下第一种方法 就是靶向敲除后再敲入 这种方法呢就是麻烦一些，需要两次的靶向，引入抗性，再把抗性基因替换。 缺点：操作步骤较多，花费…

基因敲入小鼠模型 (knock in 小鼠模型)可以模拟人类遗传机制，探索致病机制，示踪基因表达，追溯细胞起源，加速药物研发。 基因敲入模型包括常规基因敲入、点突变、条件性点突变和人源化 (humanization)模型。

NeonTM 转染平台(Thermo Fisher,MPK5000)。 包含以下仪器与耗材:NeonTM 转染仪、NeonTM 移液器、NeonTM 移液器架。 NeonTM 转染试剂盒-10 μL 体系(MPK1096),开封前室温保存,首次使用后,将缓冲液储存于4°C 冰箱。 试剂盒中包含以下试剂与耗材: 细胞培养 1. 每2-3 天更换一次培养基。 2. 当细胞汇合度为80-90% 时,进行细胞传代。 3. 细胞铺板浓度:2 × 105 个细胞/ml。 4. 电转前1-2 天进行细胞传代。 注意: 一般情况下,建议使用传代数尽量低的细胞,不建议使用传代20 代后 …

2021年10月23日 · 当mRNA的模板或者翻译复合物有缺陷时，或者新生的多肽在翻译延伸或者终止过程中阻止核糖体的前进或者脱离时，翻译过程的QC事件将被激活，从而促使暂停的翻译复合物解体，回收或者降解单独的mRNA、核糖体、多肽等。 在翻译过程的QC事件中，有两条QC通路可能会参与CRISPR/Cas9介导的KO的mRNA的降解。 第一条也是最主要的一条通路是无意义介导的mRNA的降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD），当核糖体遇到提前终止密码子发 …

基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 赛业生物科技基因敲除鼠 ,  基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的 …